In dem Shakespeare-Stück "Macbeth" flieht Macduff als Reaktion auf die Ermordung von Duncan durch Macbeth nach England, um Malcolm, den Sohn und Erben von Duncan, zu unterstützen. Auf der Flucht nach England verurteilt Macduff jedoch seine eigene Familie, die daraufhin von Macbeth ermordet wird. Auf der Flucht nach England versucht Macduff auch, Malcolm mit einer Machtdemonstration davon zu überzeugen, den schottischen Thron zurückzuerobern.
In dem Stück beinhaltet Macduffs erster Dialog die Entdeckung der Leiche von König Duncan in Macbeths Schloss. Seine Entscheidung, nach England zu fliehen, beruht auf seinem Verdacht, dass Macbeth tatsächlich der Mörder von Duncan war. Während er in England ist und versucht, Malcolm zum Handeln zu bewegen, wird Macduff von einem anderen schottischen Thane namens Ross über den Tod seiner Familie und die Folgen seiner Tat informiert.
Macduff kehrt schließlich zusammen mit Malcolm und ihren englischen Verbündeten nach Schottland zurück und trifft Macbeth im Kampf bei Dunsinane Castle. Macduff tötet Macbeth schließlich, obwohl dies im Stück außerhalb der Bühne geschieht. Dann präsentiert er Malcolm seinen Kopf und erklärt ihn zum rechtmäßigen König von Schottland.
Vor der Ermordung von König Duncan durch Macbeth trug Macduff den Titel Thane of Fife. Die ersten Hinweise auf Macduff finden sich in einem Werk aus dem 14. Jahrhundert namens "Chronica Gentis Scotorum".
