ATP-Synthase phosphoryliert ADP zu ATP. Dieses Enzym ist in die innere Membran der Mitochondrien eingebettet. ATP-Synthase wird auch F0F1-ATPase genannt, weil sie aus zwei Teilen besteht: einem F0-Anteil, der in der Membran sitzt und einem F1-ATPase-Abschnitt, der in der Matrix der Mitochondrien liegt.
Um ADP zu phosphorylieren, gelangen Protonen aus der Region zwischen der inneren und äußeren Membran der Mitochondrien in den ATP-Synthase-Komplex. Der Prozess des Eintritts von Protonen in den Protonenkanal des F0-Teils des Enzyms erzeugt Energie, um den Prozess der Addition einer Phosphatgruppe an ADP durch den F1-ATPase-Teil anzutreiben.
Die Energie von Protonen, die in den Protonenkanal eintreten, dreht auch einen Teil der F1-ATPase, der als zentraler Stiel bezeichnet wird. Wenn sich der zentrale Stiel dreht, wird eine Phosphatgruppe zu ADP hinzugefügt und dann wird das neu synthetisierte ATP-Molekül freigesetzt.