Die Unabhängigkeitserklärung wurde von 56 Personen unterzeichnet. Obwohl John Hancock, der Präsident des Kontinentalkongresses, das Dokument am 4. Juli 1776 unterzeichnete, fügten die meisten Delegierten ihre Unterschriften wahrscheinlich am 8. . 2, 1776. Der letzte Unterzeichner fügte seinen Namen am 4. November 1776 hinzu.
Die Unterzeichnung der Unabhängigkeitserklärung war eine symbolische Geste, da sie bereits durch eine Abstimmung im Kongress offiziell wurde. Die Unterschrift von John Hancock war nicht nur die erste, sondern auch die größte. Es war so ikonisch, dass sein Name zum Synonym für das Wort "Unterschrift" wurde. Historiker sind sich nicht einig, ob die meisten Delegierten am 4. Juli oder am 2. August unterzeichnet haben. Einige Delegierte müssen jedoch nach dem 4. Juli unterzeichnet haben, da sie dem Kongress nach der Annahme des Dokuments am 4. Juli beigetreten sind. Der letzte Unterzeichner war Matthew Thornton aus New Hampshire, der im November 1776 dem Kontinentalkongress beitrat und in der unteren rechten Ecke des Dokuments unterzeichnete. Der jüngste Unterzeichner war Edward Rutledge mit 26 Jahren und der älteste Benjamin Franklin mit 70 Jahren.
Nicht alle Delegierten des Zweiten Kontinentalkongresses haben die Unabhängigkeitserklärung unterzeichnet. Einige hatten dagegen gestimmt, andere waren abwesend, als das Dokument unterzeichnet wurde. Die erste an die Bundesstaaten versandte Version enthielt nicht alle 56 Unterschriften, aber am 18. Januar 1777 ordnete der Kongress an, dass eine weitere Version mit den Unterschriften an die 13 Bundesstaaten verteilt wird.
