Erwachsene Vampirfledermäuse fressen nur Blut, während junge Vampirfledermäuse sich bis zum Alter von drei Monaten von der Milch ihrer Mutter ernähren, bevor sie dann auf eine Blutdiät umstellen. Die Vampirfledermaus frisst hauptsächlich Blut von großen Haussäugetiere wie Pferde und Rinder, ernährt sich jedoch gelegentlich von menschlichem Blut. Die haarige Vampirfledermaus und die weißflügelige Vampirfledermaus bevorzugen jedoch beide das Blut von Vögeln.
Vampirfledermäuse tauchen nachts aus Höhlen, alten Gebäuden, hohlen Bäumen und anderen dunklen Quartieren auf, um zu jagen. Wenn sie Beute finden, landen sie und bewegen sich auf allen Vieren darauf zu. Um bei ihren Opfern Punkte zu lokalisieren, an denen Blut knapp unter der Oberfläche fließt, verwenden sie Thermorezeptoren an ihrer Nase, um durch Infrarotstrahlung Hitze auf der Haut ihrer Beute zu erkennen. Sie kriechen an ihre Opfer heran und machen mit ihren scharfen Schneidezähnen einen Schnitt. Der Speichel von Vampirfledermäusen enthält Antikoagulanzien, die den Blutfluss beim Fressen unterstützen.
In 20 Minuten können Vampirfledermäuse die Hälfte ihres Körpergewichts an Blut verbrauchen. Obwohl sie es schnell verdauen und kurz nach der Nahrungsaufnahme anfangen zu urinieren, sind sie beim Flugversuch extrem schwer. Vampirfledermäuse sind die einzigen Fledermäuse, die vom Boden abheben können. Sie ducken sich und werfen sich bis zu 3 Fuß in die Luft, während sie mit den Flügeln schlagen. Nach der Fütterung kehren Vampirfledermäuse in ihre Unterschlupf zurück, um sich dort niederzulassen und ihre Nahrung zu verdauen.
