Einige wichtige Städte auf einer Karte des Ohio River sind Pittsburgh, Pennsylvania; Cincinnati, Ohio; Louisville, Kentucky; Huntington, West-Virginia; und Evansville, Indiana. Andere bemerkenswerte Orte entlang des Ohio River sind die Städte Parkersburg, Wheeling und Weirton in West Virginia sowie die Stadt Owensboro in Kentucky.
Der Ohio River beginnt in Pittsburgh. Von dort fließt der Fluss nach Norden durch die Pennsylvania-Städte Sewickley, Coraopolis, Ambridge und Aliquippa. Bei der Stadt Rochester wendet sich der Ohio River nach Westen. Der Fluss fließt dann an den Städten Beaver und Midland vorbei, bevor er die Grenze von Pennsylvania zum Bundesstaat Ohio erreicht.
Nach der Stadt East Liverpool in Ohio wendet sich der Fluss nach Süden. Die Route des Flusses definiert Ohios Grenze zu West Virginia. Städte auf der Ohio-Seite des Flusses sind Steubenville, Martins Ferry, Marietta und Gallipolis. Städte auf der West-Virginia-Seite des Flusses sind Wheeling, New Martinsville, Parkersburg, Point Pleasant und Huntington.
Um die Stadt Ironton in Ohio beginnt der Ohio River, die Grenze zwischen den Bundesstaaten Ohio und Kentucky zu definieren. Einige Städte in Kentucky jenseits der Grenze zu Ohio sind Ashland, Vanceburg, Maysville, Brooksville und Newport. Nachdem der Fluss Cincinnati passiert hat, beginnt der Fluss, die Grenze von Kentucky zu Indiana zu definieren. Nachdem er die Indiana-Stadt Mount Wilson passiert hat, definiert der Ohio River die Grenze von Kentucky zu Illinois. Der Ohio River mündet bei Cairo, Illinois, in den Mississippi.
